T cell characteristics associated with toxicity to immune checkpoint blockade in patients with melanoma

今天来分享，这篇发表在nature medicine上面的文章，文章的标题是：T细胞特征与接受免疫检查点抑制剂治疗的黑素瘤患者的治疗毒性相关。

研究背景：

主要内容：

ICI治疗时，irAEs发生概率较高。
研究对象：接受了抗PD-1或者是抗PD-1，抗CTLA-4联合治疗的黑色素瘤患者。
核心工作：主要确定了两个因素与严重的不良反应有关，一个是激活的CD4记忆T细胞丰度，另一个是TCR多样性。

研究流程：

样本取的是患者治疗前后的外周血，治疗前取了78份样本；治疗后取了15份；
对于治疗前的样本，分为了三个互不重叠的部分，分别进行单细胞和2份bulk的测序，单细胞作为发现队列；而bulk测序则分为训练和验证集，用于构建机器学习模型
治疗后的样本，进行了免疫测序

Result2 外周血中严重不良反应的决定因素

cyTOF

只有CD4效应记忆T（TEM）细胞在多重假设校正之后显著，与术前血液中较高水平相关，与严重irAE的发展有关。

RNAseq

作者对这些进行过cyTOF的样本，挑选出13个样本，进行RNAseq TCRseq和BCRseq的联合测序，并进行了可视化，随后将这些大7个cluster，以细胞状态继续分群成为32个小clutser。
为了避免说由于他们注释的失误影响到结果，使用一个seurat开发的注释工具——Azimuth，他基于seurat的开发人员收集其他研究人员的高质量注释数据，可以实现对其他样本的注释功能。
而在32种细胞状态中，作者发现CD4T5细胞缺乏CCR7和CD62L的表达，这与CD4 Tem细胞的特征一致，如上面我们提到的Tem与严重不良反应的关系，作者猜测CD4 state5细胞与严重不良反应应当有关。
接着分析了与state5相似的state3细胞，发现了他们表达谱的一致性。
而当这两个结合之后，展现出与严重不良反应更强的相关性。
接着对这个结合后的细胞集群进行进一步分析，根据HLA-DX和MKI67（该蛋白与细胞的增殖密切相关，在有丝分裂期以及分裂间期的细胞（G1、S、G2、M期）中都能检出Ki-67蛋白）的表达情况，将他们划分成为激活态和静息态集群。
- 从图D可以看到，发生严重不良反应的患者，5+3集群的细胞分数是高于不发生严重不良反应的患者。同时，在激活组中是否发生严重不良反应所表现在5+3T细胞集群上的差异是显著的，而在静息组中，他是不显著的。
- 通过由右图我们也可以得知，用他们构建模型的时候，激活态的分类效果显然更好。

TCRseq

不仅进行了RNA的测序，也对TCR进行了测序。
激活的5+3TEM细胞的TCR克隆型的多样性和严重不良反应有关。
作者使用香农熵来衡量TCR克隆型的多样性。
总的来说，这些发现表明，在CD4记忆效应型T细胞的基线上具有更多样化的TCR库，从整体上反映在外周血中，与严重的ICI毒性的发展相关联。

Result3 与irAEs相关的T细胞特征的进一步分析

作者使用了来自患者的bulk细胞测序，验证先前的单细胞分析结果
- 首先使用CIBERSORT鉴定了细胞亚群，并将他们和CyTOF和scRNA的结果进行了对比，以保证数据的可信度。
- 又使用MiXCR从bulk数据中计算了TCR的克隆型的情况。
- 图a显示：在两个数据集中，激活的CD4细胞与严重不良反应相关。
- TCR克隆的多样性同样与激活的CD4细胞呈正相关。
当我们经过单细胞发现和bulk验证之后，这两者的结果都说明，都说明了TCR克隆的多样性、激活的CD4TEM细胞水平这两个因素与严重的不良反应相关，所以作者觉得可以构建一个综合这两个因素的评分模型。
- 作者按照：控制治疗方式，改变训练样本；控制训练样本，改变选定的治疗方式。两种方式训练了多个模型：
  - 图D根据这两个特征训练出来的模型，不同黑素瘤亚型、治疗方法、发生不良反应的器官、年龄、性别、免疫治疗响应不会显著影响到预测效果，模型较为稳健，AUC值高，验证效果好。
  - 证明模型的稳健性后，作者开始探究模型的功能：
  - 首先是得分与不良反应严重程度的关系：模型计算的高得分，代表了高等级的不良反应，而AUC曲线显示对于各个不良反应分级，效果也相当不错。
  - 同时对于预测多器官的irAEs，模型同样是有效的。

Result4

以往的研究发现，免疫治疗后产生致死性irAEs的黑色素瘤患者的受影响器官中，自体T细胞和抗病毒T细胞均出现了克隆扩张。
因此研究人员猜测，产生严重irAEs的患者的血液中的T细胞应该也会出现TCR亚型的扩张。为了验证这个猜想，研究人员利用immunoSEQ分析了15例转移性黑色素瘤患者的治疗前和治疗早期血液样本。
图A：首先，作者分析了immunoSEQ的测序结果和bulkRNA-seq计算的结果是否是相关的，证明immunoSEQ的数据是有效可用的。
图B C：
- 接着验证上述假设的正确性：
- 通过图B，我们可以看到，发生严重不良反应的患者，相较于治疗前，治疗中外周血的T细胞倾向于克隆扩张。
- 图B则说明了：日后发生严重不良反应的患者的TCR
- 图C对比了两组患者治疗前外周血出现的克隆型，占治疗后外周血中克隆型的分数，发现发生严重不良反应的患者占比是更高的。这说明了发生严重不良反应的患者，治疗前克隆型的持久性更高。
图C：接着用GSEA的方法，计算CD4 3+5细胞的富集分数，发现持久性CD4细胞集群的富集分数是最高的，证明两个细胞集群之间可能是相似的。
图D：最后，作者还探究了早期治疗过程中，患者外周血的TCR克隆与发生不良反应时间的关系，看出来越早发生严重不良反应的患者，他们的TCR扩张倾向是越大的。另外作者很严谨地，为了排除采血时间，血液样本新鲜程度对于结果的影响，在进行完所有样本的分析之后，作者接着选出了一个月内样本进行同样的分析，依然得到相同的结果。

Result5

最后，我们具有严重不良事件（irAE）发展风险的患者的基线外周血基因组是否与临床自身免疫性相平行。

系统性红斑狼疮（SLE）或炎症性肠病（IBD）患者，以健康样本对照。

作者认为由免疫检查点抑制疗法引起的免疫不良反应，可能是自身免疫病的一种表现形式。从图中我们可以看到作者分析得到的激活的CD4T细胞。